le clonage biologie moleculaire

LE CLONAGE

Le clonage moléculaire se rapporte à la réplication et à la recombinaison des molécules d'ADN. Les premières expériences de clonage ont été effectuées pendant les années 1970, quand des endonucléases de restriction ont été découvertes. Les endonucléases de restriction sont des enzymes qui sélecteur fendent et coupent l'ADN comme des ciseaux.

Ces enzymes ont permis à des scientifiques de couper une pièce spécifique d'ADN, habituellement un gène, et les collent dans un vecteur où elle pourrait être copiée. Dans le procédé, des modifications peuvent également être apportées au segment d'ADN copié. Le clonage est devenu une méthode fondamentale de biologie moléculaire, et sert de base à beaucoup de ce qui est connu aujourd'hui au sujet de la génétique.

L'opération de base du clonage est l'isolement d'une séquence d'ADN de n'importe quelle substance et de la mise en place dans une pièce du transporteur ADN, appelée un vecteur, pour le bouturage à l'intérieur d'une substance d'hôte, qui est habituellement les bactéries ou la levure. Ces clones peuvent alors être employés pour l'analyse génétique, pour produire la protéine, pour la mutation, et beaucoup d'autres buts.

Le flux de travail du clonage a quatre opérations :

1. L'ADN est isolé
2. L'ADN d'isolement est inséré dans un vecteur de clonage
3. Des vecteurs sont propagés dans un hôte
4. Des hôtes contenant la garniture intérieure d'ADN sont sélectés

Isolement d'ADN

Une expérience de clonage commence en recensant la partie d'ADN qui est visé pour le clonage. Souvent, c'est un gène complet. La plupart de méthode classique pour copier le gène est par amplification en chaîne par polymérase (PCR). L'ACP amplifie seulement la partie désirée d'ADN.

Une fois que l'ADN est amplifié, les extrémités sont préparées pour la ligature avec des enzymes de restriction. Des enzymes de restriction sont choisies pour leur compatibilité avec le vecteur désiré. Le segment amplifié de gène est alors incubé avec des enzymes de restriction pour couper les extrémités tellement il y a un porte-à-faux approprié pour la ligature.

En même temps, un vecteur est préparé pour recevoir l'ADN avec les mêmes extrémités surplombantes.

Le vecteur contient habituellement d'autres gènes qui sont utiles pour le clonage, tel que des promoteurs et gènes pour la résistance aux antibiotiques qui peut être employée pour le choix.

Ligature

Pendant la ligature, le gène amplifié à copier est incubé avec le vecteur. Les fins de chacune ont été préparées avec des enzymes de restriction pour avoir les pièces surplombantes complémentaires d'ADN monocatenaire. Les acides nucléiques sur ces parties surplombantes appareillent les uns avec les autres, et une enzyme de ligase est employée pour combler les lacunes entre les acides nucléiques.

Transformation

Une fois que le vecteur d'ADN est préparé, il doit être propagé dans les bactéries. Le procédé d'induire les bactéries reprendre le vecteur d'ADN est transformation appelée. Des bactéries sont habituellement préparées pour la transformation par demande de règlement avec du chlorure de calcium.

Les bactéries transformées sont développées dans la culture. Une méthode est exigée pour sélecter seulement ces bactéries qui ont repris et ont exprimé le vecteur ADN. La plupart de méthode classique est par l'utilisation d'un gène pour la résistance aux antibiotiques, compris dans le vecteur. Les medias d'accroissement pour les bactéries contient l'antibiotique, de sorte que les cultures donnantes droit devraient seulement contenir avec succès les bactéries transformées.

La première expérience de clonage moléculaire a été complétée en 1973. La méthode est maintenant devenue courante, et beaucoup d'innovations ont été introduites pour faciliter le clonage moléculaire plus rapide, plus fiable, ou personnalisable pour les types spécifiques des gènes et d'applications.

Des technologies neuves de clonage ont été inventées, aussi bien, qui profilent le procédé dans un unique, réaction d'un-tube. Ceux comprennent le clonage indépendant de séquence et de ligature (SLIC), l'Assemblée de Gibson, le clonage de passerelle, et plus.

Est ce qu'on peut faire des OGM (organismes génétiquement modifiés) ? Oui

Est ce qu'on peut faire produire à un organisme hôte une protéine pour l'étudier ou pour soigner ?
Oui, c'est aussi pour cela que la biologie moléculaire s'est particulièrement développée.

Est ce que cela permet de réaliser des études fondamentales du fonctionnement d'un gène (effet de
mutation, surexpression...) ? Oui, à partir du moment ou on fait un clonage moléculaire, on peut
cloner un gène, modifier une séquence du gène, et fabriquer une protéine mutante.

Reproduire des animaux à l'identique ? Non


LE CLONAGE : isoler un fragment d'ADN à partir de la source d'origine et l'introduire dans un vecteur
de clonage. *

Références

1. Fondations de clonage moléculaire--antérieur, présent et futur, https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/foundations-of-molecular-cloning-past-present-and-future
2. Construction des plasmides bactériens biologiquement fonctionnels in vitro, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4594039
3. Clonage moléculaire : un manuel de laboratoire, https://www.cshlpress.com/pdf/sample/2013/MC4/MC4FM.pdf
4. Biologie moléculaire du 4ème ed de cellules., https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21054/